La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una duplicación inducida artificialmente de secuencias de ADN seleccionadas deliberadamente. En este caso, las secuencias duplicadas se usan de nuevo como plantilla para duplicaciones adicionales, de modo que se obtiene un número exponencialmente creciente de duplicados a partir de una secuencia de salida.

La PCR se puede utilizar para proporcionar pruebas a nivel genético, por ejemplo, para resolver delitos (huella genética), para detectar enfermedades hereditarias, infecciones virales o para aclarar las relaciones familiares (pruebas de paternidad, árboles genealógicos). Una desventaja de este método es que no es posible replicar hebras de ADN completas, sino sólo secciones cortas (hasta un máximo de 40 kilopares de bases (kpb), es decir, 40.000 pares de bases). Para realizar una PCR, son necesarias las siguientes cosas:

• La secuencia de partida de ADN a examinar (molde, Engl. Plantilla).
• Dos cebadores creados artificialmente (construidos) como puntos de acoplamiento para la polimerasa.
• ADN polimerasa resistente al calor (generalmente la llamada polimerasa Taq, una enzima resistente al calor de la bacteria Thermus aquaticus que vive en géiseres).
• Una solución que contiene, entre otras cosas, las bases necesarias (trifosfatos de desoxirribonucleósidos) como bloques de construcción y proporciona un entorno de trabajo adecuado para la polimerasa (solución tampón).
• Un dispositivo adecuado que genera las temperaturas requeridas para las etapas individuales (termociclador).

Para que esta reacción química se lleve a cabo en tiempos razonables, se deben emplear enzimas que además de acelerar la rapidez de la reacción, debe ser estable en las condiciones de trabajo. En ese sentido, la Taq polimerasa, como se verá, significó un gran avance. Por otro lado, también se emplean otras enzimas con otros propósitos que aumentan la potencia de los estudios genómicos.

La importancia de la Taq polimerasa en la PCR

La PCR tuvo sus problemas en sus inicios. Por ejemplo, primero se usó una ADN polimerasa térmicamente inestable para el alargamiento y se tuvo que añadir esta enzima nueva después de cada etapa de desnaturalización. Además, se emplearon tres baños de agua con diferentes temperaturas. Para una PCR de 30 ciclos, esto significaba añadir la enzima 30 veces y convertirlo 90 veces.

El avance metodológico se publicó en el año 1988, cuando se introdujo la polimerasa Taq. La enzima termoestable sobrevivió a la desnaturalización y no tuvo que añadirse de nuevo después de cada ciclo. Además, se mejoraron la especificidad, la sensibilidad de detección y el rendimiento. Gracias a la polimerasa Taq, la PCR se pudo automatizar y los primeros termocicladores salieron al mercado a finales de los años 80.

La polimerasa Taq sigue siendo una enzima popular. Se aisló del termófilo acuático amante del calor, que vive cerca de aguas termales y géiseres. La temperatura de extensión óptima de la enzima está entre 75 ° y 80 ° C y tiene una semivida de 10 minutos a 97 ° C. Si la enzima se añade sólo después de la primera etapa de desnaturalización más larga, la vida útil y la actividad se prolongan significativamente. La reducción de la temperatura de desnaturalización a 95 ° C tiene el mismo efecto. 

Además, pueden compensar una disminución de la actividad mediante incrementos de tiempo en la fase de elongación. El Taq tiene una velocidad de extensión de 2 a 4,5 kilobases por minuto y, por supuesto, comete errores. Se dice que produce un error en promedio cada 4200 bases, pero muchas publicaciones demuestran que solo cada 10.000 a 125.000 bases se incorpora un nucleótido incorrecto.

¿Qué aplicaciones tienen las enzimas de restricción en los estudios genómicos?

Las enzimas de restricción son herramientas importantes en la biología molecular clásica y moderna. Las enzimas de restricción, también endonucleasas de restricción, reconocen secuencias de ADN específicas y luego cortan el ADN directamente en el sitio de reconocimiento o a una distancia definida. Las enzimas de restricción se usan tradicionalmente en biología molecular para la clonación. Aquí, la digestión del ADN por las enzimas se usa para producir extremos de ADN compatibles. Estos extremos se conectan entonces por medio de una ADN ligasa.

El ADN a clonar puede ser muy diferente, desde ADN genómico, hasta ARNm transcrito en ADNc, hasta un gen previamente clonado que necesita moverse de un vector a otro (subclonación). Las enzimas de restricción también se pueden usar para crear extremos compatibles de productos de PCR. En todos los casos, se usan una o más enzimas de restricción para digerir el ADN, lo que permite una inserción no dirigida o dirigida en el plásmido compatible.

Los termocicladores de Kalstein como soporte en la investigación en biología molecular

Todos los estudios que involucren pequeñas muestras de ADN y se requiere su multiplicación, hay que recurrir a la metodología de la PCR, la que a su vez se soporta en un termociclador. Kalstein, es un fabricante de equipos de alta calidad en este ramo, y sus termocicladores, tienen como características principales su robustez para trabajo prolongado, enfriamiento por tecnología Peltier y una interfaz que facilita su manejo. La compra de estos equipos, sus precios y cotización, se puede consultar en las páginas AQUI y AQUI.