La genética ha sido tradicionalmente una disciplina que se centró en el análisis de la variación hereditaria; estas variantes genéticas sirvieron como un medio (como marcadores en el mapeo genético o en estudios de población) o como un fin (estudios de estructura/función de tipo salvaje frente a mutantes).
El advenimiento de las técnicas de clonación molecular y ADN recombinante, como la transferencia Southern, permitió el análisis de la variación de la secuencia de ADN y marcó una nueva era en la genética molecular. La introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método in vitro para la amplificación enzimática de segmentos de ADN específicos a partir de un genoma complejo, ha simplificado enormemente el estudio de la variación de secuencias y, como resultado, ha transformado la forma en que se puede llevar a cabo el análisis genético.
La amplificación por PCR de un segmento de ADN específico a partir de ADN genómico o a partir de ARN, después de la transcripción inversa, puede reemplazar la construcción de bibliotecas genómicas para muchas aplicaciones y, en otras, puede facilitar en gran medida los procedimientos posteriores, tales como:
- Clonación.
- Secuenciación.
- Hibridación de sondas de oligonucleótidos.
- Análisis de sitios de restricción.
Por otro lado, la disponibilidad de instrumentos de secuenciación automatizados promete que el análisis de secuencias de productos de PCR no solo será un procedimiento de investigación crítico, sino que, en última instancia, también se puede utilizar en un contexto de diagnóstico clínico, para diversas enfermedades con origen genético.
Ventajas del uso de la PCR en la caracterización genética
Además de simplificar muchos procedimientos y, por lo tanto, permitir el uso de técnicas moleculares en una amplia variedad de disciplinas biológicas, la PCR ha hecho posibles nuevos enfoques para el análisis genético basados en la capacidad de amplificar muestras muy pequeñas (p. mapeo de espermatozoides). Hay una serie de ventajas en el uso de un ensayo de PCR para determinar el genotipo de una muestra de ADN:
- El ensayo toma sólo unas pocas horas en comparación con la transferencia Southern, que puede tomar días o semanas.
- La PCR es capaz de automatizarse, lo que permite tipificar rápidamente grandes cantidades de muestras con poca mano de obra requerida.
- La PCR es económica de ADN; sólo se requieren picogramos o nanogramos, mientras que se necesitan nanogramos o microgramos para la transferencia Southern de ADN genómico.
- En una reacción de PCR, se pueden tipificar muchos loci genéticos distintos al mismo tiempo mediante amplificación múltiple usando múltiples pares de cebadores.
Como resultado de estas economías, varios laboratorios han convertido marcadores de RFLP conocidos en un formato de PCR y muchas búsquedas de nuevos polimorfismos se han centrado en aquellos que pueden ensayarse por PCR. El requisito más básico para el análisis por PCR es un conjunto de cebadores que flanquean una región de ADN polimórfica específica. Una vez que se ha amplificado un producto de PCR específico, se pueden usar diversos procedimientos para determinar el genotipo de una muestra.
Análisis de las secuencias de ADN a los productos amplificados por PCR
La caracterización más completa de un producto de PCR es la determinación de la secuencia de nucleótidos; esta es la forma más sensible de revelar el polimorfismo. Aunque el análisis de secuencia de ADN amplificado se realizó inicialmente en productos de PCR clonados, el aumento de la especificidad ha hecho que la secuenciación directa de productos de PCR sea el enfoque preferido para la mayoría de las aplicaciones.
La secuenciación directa evita problemas potenciales asociados con bases raras mal incorporadas (se deben secuenciar múltiples clones para detectar artefactos de PCR raros tales como la incorporación errónea) pero, en la amplificación de familias de múltiples genes o muestras heterocigotas complejas, la clonación a menudo es útil para separar los diferentes alelos o loci.
La secuenciación de terminación de cadena se lleva a cabo con cebadores marcados (radiactivos o fluorescentes), con DNTP marcados o con terminadores de desoxirección marcados. Los moldes monocatenarios se pueden generar usando PCR asimétrica, un enfoque en el que uno de los dos cebadores es limitante, o usando un cebador biotinilado de modo que una hebra del producto de PCR se pueda capturar mediante una perla de estreptavidina.
El uso de ADN polimerasas termoestables ha permitido el enfoque de secuenciación por ciclos en el que los ciclos repetidos de extensión y desnaturalización dan como resultado una acumulación lineal de productos de extensión de cebadores que aumentan la sensibilidad de la reacción de secuenciación. Los moldes bicatenarios se pueden secuenciar fácilmente ya que se minimiza la reasociación de las cadenas del molde.
Los termocicladores de Kalstein para la realización de la PCR
Las reacciones de PCR se llevan a cabo en un termociclador, los cuales realizan los ciclos de calentamiento para que la desnaturalización, alineamiento y elongación de la cadena ocurran. Los termocicladores del fabricante Kalstein, incorporan las últimas tecnologías en el campo, generando instrumentos muy robustos, con una elevada precisión en el control de temperatura y trabajando con un bajo nivel de ruido y bajo consumo de energía. Se pueden consultar precios, cotizaciones y compra, desde la página web AQUI o en la página AQUI.