Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico convencional al que se le adapta un accesorio complementario de iluminación, denominado “fluorescencia”. Esto lo convierte una herramienta de mucha utilidad en el campo de la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad, y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida, con la luz convencional.

La fluorescencia es parte de los procesos de luminiscencia. En el que las moléculas susceptibles emiten luz a partir de estados excitados. Que son creados electrónicamente por un mecanismo físico (por ejemplo, absorción de luz), mecánico (fricción) o químico. La generación de luminiscencia a través de la excitación de una molécula por fotones de luz ultravioleta o visible es un fenómeno denominado fotoluminiscencia. Este se divide formalmente en dos categorías, fluorescencia y fosforescencia. Dependiendo de la configuración electrónica del estado excitado y la vía de emisión.

La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas para absorber la luz a una longitud de onda particular. Y, posteriormente, emitir luz de onda más larga después de un breve intervalo, denominada vida útil de fluorescencia. El proceso de fosforescencia se produce de manera similar a la fluorescencia, pero con un tiempo de vida excitado mucho más prolongado.

¿Cómo es el proceso de fluorescencia?

El proceso de fluorescencia se rige por tres eventos importantes. Todos ocurren en escalas de tiempo que están separadas por varios órdenes de magnitud. La excitación de una molécula susceptible por un fotón entrante ocurre en femtosegundos (1015 seg). Mientras que la relajación vibratoria de los electrones en estado excitado al nivel de energía más bajo es mucho más lenta; y se puede medir en picosegundos (1012 seg). El proceso final es la emisión de un fotón de longitud de onda más larga y el retorno de la molécula al estado fundamental. Este ocurre en el período de tiempo relativamente largo de nanosegundos (109 seg).

Toda la vida útil de la fluorescencia molecular, desde la excitación hasta la emisión, se mide en solo mil millonésimas de segundo. El fenómeno es una manifestación sorprendente de la interacción entre la luz y la materia. Esta interacción conforma la base de los campos expansivos del estado estacionario y de la espectroscopía y microscopía de fluorescencia de resolución temporal. Debido a los perfiles de emisión tan sensibles, la resolución espacial y la alta especificidad de las investigaciones de fluorescencia, la técnica se ha convertido en una herramienta importante en genética y biología celular.

Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son muchas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, sobretodo en biología y medicina:

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.
• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.

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